常见问题解答

为了减少您可能的等待时间,您不妨先仔细阅读下面的常见问题。如果问题仍无法解决,请您拨打本页页底的电话联系,谢谢您的理解!

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1. 组织RNA提取试剂盒操作注意事项

组织RNA提取试剂盒操作注意事项

 

1Wash Buffer使用前需要按照标签上写的体积加入无水乙醇

2)取组织需要尽量迅速,可以用液氮速冻,以避免RNA降解RNA降解主要发生在取组织阶段);

3)第一次做的时候,建议前两个样品按下表取相应重量的组织,称重,其余样品根据前两个样品体积来估计,切取相似大小即可;

组织种类

肝脏

肿瘤、胚胎、心、肾、脾、胰脏、肺、脑、眼

肌肉、皮肤、血管

脂肪

参考用量(mg)

5~ 10

5~ 50

20~ 50

50

4)组织称量好以后,放入破碎仪专用的2 ml离心管中,做好标记,每个加入500 ul裂解液,每管放入3~4粒钢珠,研磨3~4次(每次30 S,两次研磨中间停顿30S,以防长时间研磨产热过多导致RNA大量降解),至半透明状,看不到明显的组织固体为止组织破碎仪的钢套最好提前预冷;

5)组织裂解后,吸出液体到1.5 ml离心管中,室温放置5分钟,充分裂解组织

6)每个加入100 ul氯仿,上下颠倒10次充分混匀,然后室温放置3分钟。13000 rpm离心3分钟,使液体分层。轻轻的拿出离心管,避免晃动导致液体分层被打乱。吸取上清时,尽量小心操作,枪头随液面降低从上往下慢慢吸取上清,避免吸到中间层或者下层,建议吸取200 ul上清即可(RNA浓度已经完全足够使用),尽量不要多吸

7)如果后续RNA用来检测mRNA等常规大小的RNA,则加入200 ul无水乙醇吹打混匀,即可加入离心柱。如果后续RNA用来检测microRNA等分子量很小的RNA,则需要加入320 ul无水乙醇吹打混匀(如果出现沉淀,需要吹打至沉淀不可见为止),然后加入离心柱中。

4000g(约6500 rpm),4度离心1分钟;

8)倒掉收集管中的液体,将收集管在吸水纸(擦手纸即可)上倒扣几下,将离心柱放回收集管,加入500 ul Wash Buffer 112000g 4度离心1分钟,倒掉液体;

9)加入500 ul Wash Buffer 212000g 4度离心1分钟,倒掉液体,然后在纸上倒扣几下收集管,将离心柱放回收集管,12000g 空柱离心1分钟以充分去除残留的废液;无需倒掉废液,直接将离心柱转移至无RNase1.5ml EP管中(转移离心柱时尽量避免离心柱碰到侧壁或底部,以免废液污染了离心柱导致纯度降低)。

10)开盖晾干2分钟,加入20~30 ul Elution Buffer到离心柱中央的膜上,室温放置3分钟,12000g离心一分钟,即可得到RNA

RNA应该立即放置于冰上,然后测浓度。通常Nanodrop曲线应为正态分布图样(260 nm处峰最高),260/280260/230应介于1.9~2.2之间,表明纯度较高(最大不超过2.3)。

本试剂盒提取的RNA可用于临床体外检测使用,可以配套衔接的下游实验类型包括但不限于逆转录、qPCR,二代测序、RNA芯片、RNA甲基化检测等各种实验。



2. 细胞RNA提取试剂盒操作注意事项与技巧

细胞RNA提取试剂盒操作注意事项与技巧


1)Wash Buffer使用前须加入瓶身标签所示体积的无水乙醇混匀才可使用

2) 建议使用前把Elution Buffer分装为3~4份,以减小污染的概率;暂时不用的Elution Buffer可以冻存在-20度长期保存。做实验时恢复到常温再使用即可。如果把Elution Buffer在金属浴上提前预热到60度,然后再加入柱子膜中央使用,则能适当提高RNA产量。

3) RNA提取须在室温进行,提取过程中不可置于冰上。

4) 建议用6孔板或35 mm培养皿培养细胞,培养至贴壁细胞密度达到80%以上时进行RNA提取,不建议用100 mm培养皿培养的细胞直接裂解提取RNA,否则可能导致细胞裂解不充分或离心柱堵塞或导致基因组残留。

5) 裂解时注意事项:

a) 弃去培养基,用PBS清洗细胞(沿侧壁加入PBS轻轻晃动后,再沿侧壁吸去PBS;如果样品数较多,应分批操作,以防止因细胞晾干导致RNA严重降解);

b) 加入500 μl裂解液(Lysis Buffer),将移液器量程调至400 μl后吹打30下(吹时,液体不要完全吹出,枪头内可以留一点;吸时,液体也不要完全吸完,防止吸入气泡);或加入裂解液后将孔板吹打数次后置于水平摇床上室温摇4~5分钟,然后吹打10下,以使细胞充分裂解

6) 加入裂解液充分裂解以后,如果不打算继续进行RNA提取,可在充分裂解后将裂解产物转移到EP管中直接冻存在-80,下次解冻后恢复到室温使用,加乙醇混匀,继续向后进行即可。

7) 洗涤时注意事项:

a) 加入500 μl洗涤液(Wash Buffer)到离心柱中,12000 g离心1分钟。注意:将离心柱从收集管中取出时,应小心操作,防止离心柱底部接触到液体(建议操作:倒掉液体后,可将收集管倒扣在吸水纸上轻轻叩击两下,然后将离心柱放回收集管,12000 g空柱离心1分钟);

b) 无需倒废液,直接将离心柱取出转移至无RNase1.5 ml EP管中,开盖晾干2分钟。

8) RNA洗脱时一定要将洗脱液加到柱中央的膜上(如果洗脱液加到侧壁上,会导致RNA没有被溶解而使产量大大减少),同时注意避免移液器枪尖将膜刺破。

9) RNA提取后应该立即放置于冰上,然后测浓度。通常Nanodrop曲线应为正态分布图样(260 nm处峰最高),260/280260/230应介于1.9~2.2之间,表明纯度较高。

10) 本试剂盒提取的RNA可用于临床体外检测使用,可以配套衔接的下游实验类型包括但不限于逆转录、qPCR检测等各种实验。如果想用于二代测序则建议使用组织RNA提取试剂盒(亦可提取细胞)


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